El desarrollo de la criobiología ha permitido grandes avances en el campo de la medicina reproductiva, permitiendo realizar con garantías criopreservación de gametos y embriones. Es por ello, que vamos a explicar cuales son los fundamentos en criobiología, partiendo del trabajo publicado en la revista ASEBIR Principios básicos de criobiología (Martínez-Rodero y col).
Al exponer a organismos y tejidos vivos a bajas temperaturas, se consiguen detener procesos fisicoquímicos indispensables para la vida, así que a bajas temperaturas, se podría decir que se detiene la vida, evitando que los tejidos se descompongan.
La principal limitación que presenta esta inactividad causada por la bajada de temperatura, es el alto contenido en agua que presentan los tejidos vivos, ya que al congelarse, el agua, forma estructuras cristalinas que acaban por afectar y dañar a las estructuras celulares..
Aunque la vitrificación fue una técnica estandarizada en 2007, desde hace muchos años se estudia la criopreservación de espermatozoides animales y humanos. Un punto importante en el desarrollo de la criobiología fue el descubrimiento del glicerol, en 1949, como agente crioprotector, descubierto por casualidad y provocando un despunte en la industria de la ganadería, al poder preservar semen de sementales. Ya en 1972, se consiguió congelar el primer embrión de ratón, mediante congelación lenta. En 1984, solo 6 años después del nacimiento de la primera niña probeta, Louise Brown, se produjo el primer embarazo y nacimiento a partir de un embrión congelado. La congelación lenta fue tomando relevancia en las técnicas de reproducción asistida, hasta que irrumpió la vitrificación, tras años de estudio para solventar los problemas que presentaba.
Para que se pueda producir la criopreservación, es necesario el uso de crioprotectores. Los crioprotectores son moléculas que actúan protegiendo a las células durante el proceso de congelación. Estas moléculas evitan la formación de cristales de hielo, estabilizan las proteínas y controlan la concentración de solutos intra y extracelular.
Pero estas moléculas también tienen aspectos negativos para las células, ya que son tóxicas para ellas.
Los crioprotectores se pueden clasificar en dos grupos:
-Crioprotectores permeables:
moléculas de bajo peso molecular, que les permite atravesar la membrana celular, estabilizando proteínas intracelulares, disminuyendo la temperatura a la que se forma el hielo intracelular y reduciendo el daño osmótico originado por la concentración de electrolitos. Como ejemplo de estie tipo de crioprotectores destacan el glicerol, etilenglicol (EG), 1,2-propanediol (PROH) y el dimetilsulóxido (DMSO).
-Crioprotectores no permeables:
sus moléculas grandes, incapaces de atravesar la membrana celular, por lo que actúan desde el espacio extracelular, agilizando la salida de agua de la célula por ósmosis, facilitando además, la entrada de crioprotectores permeables que al evitan la formación de hielo dentro de la célula. Entre estos crioprotectores destacan la glucosa, sacarosa y trehalosa.
Los crioprotectores también juegan un papel importante en la descongelación de las células. Al descongelar una muestra, esta se saca del nitrógeno líquido donde estaba almacenado a -196ºC y se pasa a un medio que se encuentra a 37ºC. Este medio, contiene una alta concentración de crioprotectores no permeables, que se equilibra con la alta concentración que también presenta el interior celular, por lo que la entrada de agua a la célula, se produce de forma más relajada, evitando un choque osmótico.
Ahora, vamos a proceder a explicar los diferentes protocolos de criopreservación actuales:
1-Congelación lenta:
Técnica usada hasta la irrupción de la vitrificación. También se conoce como criopreservación en equilibrio. En este caso, se evita la formación de cristales de hielo por deshidratación. Los medios usados, suelen contener una concentración 1,5M, con crioprotectores permeables como el glicerol, EG y DMSO, además, pueden tener crioprotectores no permeables como sacarosa y trehalosa a 0,25-0,5M.
El protocolo de congelación lenta se puede dividir en las siguientes etapas:
-Fase de enfriamiento (20º a -7ºC):
El medio de congelación está por encima de su punto de congelación. La baja concentración de crioprotector propicia una deshidratación gradual de la célula.
-Fase de superenfriamiento (-7ºC):
El medio de congelación inicia su cambio de estado. Pero este cambio debe ser controlado para evitar un superenfriamiento excesivo. Para ello, se realiza el seeding, que consiste en inducir la cristalización a -6º o -7ºC al usar una pinza sumergida en nitrógeno líquido que se pone en contacto con el sistema de congelación.
-Fase de equilibrio tras inducir el cambio de estado (-7ºC):
La parte que aún está líquida, se va concentrando cada vez más, favoreciendo la deshidratación por ósmosis.
-Fase de congelación hasta la temperatura previa a la inmersión en nitrógeno líquido (-7º a -32ºC):
Al reducir al máximo el volumen celular, se puede aumentar la velocidad de congelación cientos de veces sin que se forme hielo.
2-Vitrificación:
Se produce al originarse un estado vítreo que mantiene la distribución molecular e iónica del estado líquido. En la vitrificación, se produce la deshidratación de las células y posteriormente, se enfría la muestra mediante la exposición a concentraciones muy elevadas de crioprotectores que permiten alcanzar el estado vítreo intra y extracelular de una forma más rápida.
Como hemos dicho antes, los crioprotectores son tóxicos para las células, por lo que la vitrificación podría ocasionar riesgos a los gametos y embriones. Para ello, se presentan diferentes estrategías:
-Emplear combinaciones de crioprotectores permeables y no.
-Reducir el tiempo de exposición de los crioprotectores a las células.
-Reducir la temperatura a la que se exponen las células a las soluciones de vitrificación (20-25ºC).
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Bibliografía:
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